亚致死浓度行为效应的盲法重测：效应量能撑过预注册吗

推荐优先级：备选 · 参赛子类：Animal Sciences — Animal Behavior · 资源需求：无脊椎动物（水蚤/丰年虾或本地合法螯虾）+ 摄像头 + 草甘膦制剂；须有实体实验室做稀释与废液处置 · 技能取向：盲法实验设计 / 预注册 / 重测信度

1 · 研究问题

在明暗十字迷宫中测到的草甘膦亚致死行为效应，改成盲法评分 + 预先登记分析方案之后还剩多少？同一只个体在两个独立日重复测量时，这个行为指标本身的重测信度（ICC）是多少？

2 · 研究背景与空白

背景。 亚致死毒性行为学的逻辑是：污染物在远低于致死浓度时就可能改变动物的行为（活动量、趋光性、探索/回避倾向），而行为改变会级联到摄食、避敌与繁殖，因此比死亡率更敏感。明暗十字迷宫（light–dark plus maze）测的是动物在明区与暗区之间的分配，被当作"回避/应激反应"的代理量。但这类实验有两个几乎从不被报告的方法学前提： 第一，行为评分往往由知道分组的人做，观察者预期偏差会把效应往预期方向推，而这种偏差不报错、只是让效应变大；第二，行为指标本身在同一只个体上就有大幅波动，若不知道这个波动有多大，就无法判断组间差异是"处理效应"还是"这个指标本来就飘"。判断某个行为量能不能承载效应，靠的是它的重测信度（ICC），而不是组间 p 值。 与此相关的还有一个统计学现象：小样本下被报告的效应量系统性偏大（只有偏大的才达到显著），因此复现时效应量变大而非缩小，是需要警惕的信号而不是加强证据。

已有工作到哪一步。 ANIM054（2026，Special Award，"Glyphosate Significantly Impacts Crayfish Behavior"）本身已经是一次跨物种复现。摘要原文写明它建立在 2025 年的发现之上——红沼泽螯虾 Procambarus clarkii 在环境相关浓度 0.06–6 mg/L 草甘膦下出现不良行为反应——本届换成本地的 Faxonius virilis：暴露 96 小时于 0.06、0.6 或 6 mg/L，随后在明暗十字迷宫中评估应激反应。结果："Statistical analyses reveal that glyphosate concentrations of 0.6 and 6 mg/L significantly alter Faxonius virilis behavior. In comparison with Procambarus clarkii, an even larger effect size was noticed."

空白在于：两届都做了物种复现，两届都没有报告盲法评分，也都没有报告行为指标自身的重测信度——而效应量在复现中反而变大。 这个组合恰恰是"评分者预期偏差 + 小样本效应量膨胀"两种机制的典型指纹，但没有任何人做过能把它们排除的实验。这个空白适合一年期学生课题的理由是：无脊椎动物的毒性研究是规则允许的（脊椎动物毒性研究全面禁止），所需增量只是把标签封装、把分析方案写死、再加一天重测；水蚤/丰年虾成本极低、世代短；而且结论正负都成立——效应在盲法下幸存是对前作的独立加强，效应消失则是一个影响整类亚致死行为学实验的方法学发现。

3 · 可检验假设

H1 在盲法评分 + 预先写死的分析方案下，最高浓度组相对对照组的标准化效应量（Hedges' g）比非盲法条件下同一批数据的效应量小 ≥ 30%；判据明确：同一批录像分别由盲法评分者与知情评分者各评一遍，两套效应量直接相减。这条假设可被数据否证——若两套效应量之差 < 30%，H1 即被推翻。

H2（机制/备择假设，H1 被否证时仍有内容）无论盲法是否改变效应量，主行为指标的单次测量重测信度 ICC < 0.5；据此计算的"要把组间效应从个体内噪声中分辨出来所需的最小样本量"显著大于前作实际使用的样本量。这一条只依赖个体内重测数据，与处理效应是否存在无关。

4 · 量化验收标准

1. 方法学校验（硬门槛，不过关不许往下做，后续全部结论无效）。 用已知浓度的标准品验证配制链路：从母液开始逐级稀释到各工作浓度，用已知质量的溶质做质量平衡核算，并对至少一个工作浓度做独立复配对照，要求两次独立配制的浓度相对偏差 ≤ 5%；同时跑一次正对照与阴性对照——阴性对照为纯培养水，正对照为一个已知会改变该指标的非毒理刺激（如已知强度的光刺激），要求正对照能被本课题的评分流程稳定检出。这一步不过不许继续——若配制链路不准或评分流程连已知效应都测不出，任何"草甘膦有/无效应"的结论都无意义。
2. 统计口径预先写死——生物学重复与技术重复分开计数，只有独立暴露容器进 n。 同一个暴露容器内的多只个体不是独立样本（共享水体、共享实际浓度、共享处理误差），n 必须以独立暴露容器计，容器内个体作为嵌套层进入混合效应模型。报告必须写全三个数："n = X 个独立容器 / 每容器 Y 只 / 共 Z 只个体"。这是本课题最容易被评委问倒的一条，必须主动写在展板上。
3. 统计口径预先写死——剂量-反应必须预先定义拟合模型与区间方法。 采用四参数 logistic（4PL）拟合浓度-行为响应曲线，EC50 及其置信区间用自助抽样（bootstrap）给出；模型形式、是否固定上下渐近线、异常点剔除规则在开测前一次写死，不得事后更换模型。若同时记录死亡率，LC50 亦按 4PL 拟合并给出置信区间。
4. 统计口径预先写死——盲法与评分者间一致性在开测前定死。 处理组标签由第三人封装（容器只贴随机码，对照表由不参与评分的人保管，至全部评分完成后才揭盲）；≥ 2 位评分者对同一批 ≥ 20% 的录像独立评分，报告 Cohen's kappa（离散指标）或 ICC（连续指标）；评分者间一致性不达标（kappa < 0.6 或 ICC < 0.6）的指标一律从主分析中剔除，剔除规则开测前写死。同时保留一位知情评分者评同一批录像，专门用于 H1 的对比——这是本课题的核心设计，不可省。
5. 样本量、浓度点与重测的具体下限。 浓度点 ≥ 4 个 + 1 个对照（沿用前作的 0.06 / 0.6 / 6 mg/L 并补一个中间点，具体补点位置须在开测前定死）；每浓度 ≥ 3 个独立容器；每只个体在 ≥ 2 个独立日重测（这是 H2 的唯一数据来源，无法事后补做）。
6. 可复现性。 预注册文档（主指标、剔除标准、统计模型、样本量，带时间戳）、逐个体原始轨迹数据、随机码对照表、评分记录、4PL 拟合脚本一律开源存档，第三方可一键重跑。原始录像按可行范围存档；配制记录与废液处置记录一并公开。

5 · 数据与工具

用途	来源 / 工具
实验动物	水蚤（Daphnia magna）或丰年虾优先——无脊椎、成本极低、可购、世代短、群体量大易凑样本量。若坚持用螯虾，必须是当地合法可购的本地种。需核实供应商与本地物种合法性
受试化学品	草甘膦制剂。需核实具体产品型号、有效成分含量与助剂成分——市售除草剂含表面活性剂，其毒性可能强于草甘膦本身，若用制剂而非纯品，结论必须表述为"该制剂"而非"草甘膦"。须逐一查 SDS
行为记录	固定俯拍摄像头 + 明暗分区容器。水蚤/丰年虾改测趋光性与游动轨迹（迷宫逻辑保留，几何简化）
轨迹提取	开源追踪工具（Trackpy 一类）或人工计数分区停留时间。需核实所选工具对半透明小型甲壳类的追踪成功率，并实测其漏检率——不得假定可用
统计	Python/R：4PL 拟合（scipy.optimize 或 R 的 drc 包）、混合效应模型、ICC、bootstrap。纯 CPU
预注册	任何带时间戳的公开存档方式（版本库 commit、公开表单）。需核实所选方式能否提供不可篡改的时间戳
对照基准（仅用于校验与对比，不计入本项目的数据贡献）	ANIM054（2026，Special Award）摘要中的 0.06–6 mg/L、96 小时暴露、0.6 与 6 mg/L 显著、"an even larger effect size"；用作设计参照与结果对照，其任何数字不得写成本项目结果
须核实项	① 能否使用实体实验室做稀释与废液处置——草甘膦废液不得倒入下水道，须按危险废物处置，这一项必须在开题前落实；② 制剂中助剂的成分与毒性；③ 水蚤/丰年虾的培养稳定性（培养崩溃是本课题最常见的中途翻车方式，须提前起备用培养）；④ 追踪工具的漏检率；⑤ 当地对草甘膦购买与使用的规定
不可用路径（已排除）	用鱼类（含斑马鱼）做同一实验——脊椎动物毒性研究全面禁止，斑马鱼受精后 7 天（7 dpf）起即算脊椎动物，直接违规。 用小龙虾等入侵种——规则明确禁止向环境引入非本地物种，且许多地区对其运输饲养有法规限制。在家中做稀释与暴露实验——化学品操作须有成人监督与合规处置，且若 SDS 标注致癌/致畸/生殖毒性则必须在 RRI 或限制进入的通风橱内进行

6 · 方法路径

1. 建体系并完成 §4 第 1 条校验 + 完成预注册。 建立培养、配制、暴露、录像、评分全链路；跑通已知浓度标准品的质量平衡核算（复配偏差 ≤ 5%）与阴性/正对照。在第一只动物进入暴露之前，把预注册文档带时间戳公开——主指标、剔除标准、统计模型、样本量、浓度序列全部写死。这一步不过不许继续，且预注册一旦发布不得修改。
2. 核实工具与生物材料的能力边界，逐条实测下列静默失败点： ① 观察者预期偏差——评分者知道分组时会向预期方向漂移，且完全不自觉，这正是本课题要量化的对象，靠随机码封装 + 知情/盲法双评分设计捕捉；② 群体饲养导致的伪重复——同一容器内的个体共享水体与实际浓度，不是独立样本，若按个体数报 n 会把有效样本量高估数倍，这是亚致死毒理里最常见的静默错误；③ 检测限以下的删失被当成 0——低浓度组的行为改变若小于测量分辨率，记为"无差异"会把剂量-反应曲线在低端强行压平，必须显式区分"未检出"与"确实为零"；④ 光照/温度昼夜节律混杂——趋光性与活动量本身随昼夜与水温强烈变化，若不同处理组在不同时段测量，时段效应会被完整地读成处理效应，必须把测量时段随机化并记录水温；⑤ 追踪软件的静默漏检——半透明小型甲壳类在低对比度背景下会被整段漏掉，软件不报错只是给出更少的轨迹点，必须用人工计数一小段做漏检率实测。
3. 建立稳定培养并起备用培养。 培养崩溃无法在赛季内补救，从第一天起就要有两套独立培养。
4. 执行暴露实验。 ≥ 4 个浓度点 + 对照，每浓度 ≥ 3 个独立容器，暴露时长沿用前作的 96 小时以保持可比性。容器只贴随机码；配制与投放由一人完成，评分由另一人完成，对照表由第三人保管。
5. 完成盲法评分 + 知情评分双轨评分，并做个体内重测。 同一批录像由盲法评分者与知情评分者各评一遍（H1 的直接数据）；每只个体在 ≥ 2 个独立日重测（H2 的唯一数据来源）。涉及主观判断的每一处（分区边界、停留判定、无效试次）须给出明确、可复现的判据并写入评分手册，手册随数据公开。
6. 揭盲并按预注册方案分析。 拟合 4PL 剂量-反应曲线、给出 EC50 及自助抽样置信区间、计算 ICC 与所需样本量、对比盲法与知情两套效应量。任何偏离预注册的分析都必须单独列为"探索性分析"并明确标注，不得混入主结论。
7. 独立交叉校验：用另一种方法算同一个量。 用一个完全不依赖人工评分的自动化指标（如单位时间总位移、明区停留时间占比的自动计算）重算同一效应，与人工评分结果对照。若自动指标与盲法人工评分一致而与知情评分不一致，这就是预期偏差最干净的证据。

7 · 新颖性边界

本课题不声称： - 不声称首次研究草甘膦的亚致死行为效应。ANIM054（2026，Special Award）已在两个物种上做过，并报告 0.6 与 6 mg/L 下行为显著改变。 - 不声称发现"环境相关浓度的草甘膦会改变甲壳类行为"。 这是前作在 Procambarus clarkii（2025）与 Faxonius virilis（2026）上的结论，不得写成本项目发现。 - 不声称前作的结论是错的。 本课题不复现其物种、不接触其数据，无法对它的具体结果下判断；本课题给出的是"这类实验在不做盲法时效应量会被抬高多少、这个行为指标本身有多稳"的一般性证据。这个区分必须在展板上写清楚，否则会被读成越权指控。 - 不对草甘膦的生态风险或人类健康做任何声称——本课题只测一个行为指标的方法学性质。 - 不提出新的行为学范式或新的统计方法。盲法、预注册、ICC、4PL 都是既有工具。

已有工作做到哪： ANIM054（2026，Special Award）在 Faxonius virilis 上做 96 小时暴露（0.06 / 0.6 / 6 mg/L）后用明暗十字迷宫评估应激反应，报告 0.6 与 6 mg/L 显著改变行为，且相对 2025 年的 Procambarus clarkii "an even larger effect size was noticed"。两届均未报告盲法评分、评分者间一致性、行为指标的重测信度，也未给出剂量-反应拟合与 EC50。

本项目的贡献（属「方法可复现性贡献」型）： 生物学结论已由前作发表，本项目的贡献是给这类亚致死行为学实验补上盲法对照、预注册与重测信度这三项缺失的方法学基础，并把定性的"显著改变"升级为带置信区间的剂量-反应曲线。这是主结论，交付物就是那个盲法/知情效应量差、那个 ICC 与那条 4PL 曲线。

为什么有价值： 亚致死行为学正在成为环境毒理里最热的一类学生课题，而"效应量在复现中变大"这个现象若源于评分偏差，会让整条证据链虚高；给出偏差的量级与指标的信度，比再复现一个物种有用得多。

若结论不显著： 若盲法与知情的效应量差 < 30%、且 ICC ≥ 0.5，H1 与 H2 均被否证——"这类实验比想象的稳健、前作的效应经得起盲法检验"同样是有效结论，而且是对前作最有力的独立支持。但必须给出误差棒证明有能力分辨这个差异：效应量差的置信区间若宽到跨越 0 与 50%，那叫样本量不足，不叫"没有偏差"。

8 · 决策门槛（go / no-go）

🔴 条件 1（第 4 周末，即 2026 年 9 月初）：实体实验室与废液处置渠道落实，且预注册文档已发布。 若落实不了实验室或合规处置，立即降级： 降级路径是换掉受试化学品，保留全部方法学设计——改用一个不属于危险化学品、可在学校实验室安全使用的行为活性物质（例如已知的温度梯度、盐度梯度或光强梯度这类物理胁迫），课题变为"亚致死行为学指标的盲法效应量偏差与重测信度标定"。主结论框架（盲法差多少、指标有多稳、剂量-反应长什么样）完全保留，只是把化学暴露换成物理胁迫。这不是换课题。

🟡 条件 2（第 8 周末，即 2026 年 9 月底）：培养稳定，且完成一次完整的预实验（含盲法双评分）。 若培养反复崩溃或预实验的盲法/知情两套评分无法在同一批录像上完成，立即降级： 把浓度点从 4 个减到 3 个（保留前作的 0.06 / 0.6 / 6 三点以维持可比性）、把重测从 2 天扩展为主交付物，主结论从"盲法效应量差"改为"该行为指标的重测信度与所需样本量"（即以 H2 为主线）。H2 只需要重测数据，不依赖处理效应是否存在，这是本课题最稳的兜底。

⚠️ 与「附属赛后不得修改」的冲突点： 五件事一旦在附属赛后想改就不被允许——① 预注册中的主指标；② 剔除标准；③ 4PL 的模型形式与渐近线是否固定；④ 浓度序列；⑤ 评分者一致性剔除阈值。必须在 11 月底前定死——事实上本课题的设计要求它们在第一只动物入组之前就已经定死并公开时间戳，这比赛制要求更严，是主动的。

须提前核实而非边做边发现的事项： - 本方向未做外部文献核查，"未找到前作"不等于"不存在前作"。 生态毒理学关于盲法与重测信度的方法学讨论很可能已有正式文献，学生必须在开题前自行补检索，并在研究计划中说明本课题的定位是把既有方法学要求用在一个具体的、被反复重复的实验范式上，不是提出新方法。 - 市售制剂的助剂成分。 若用制剂而非纯品，结论只能表述为"该制剂"；这一点必须在开题前想清楚，否则整篇的表述都要返工。 - 追踪软件对半透明小型甲壳类的漏检率。必须实测，不能假定。 - 废液处置方案。必须在实验开始前落实，不得边做边发现无处可倒。

已知困难及其定位： 最大的困难是"要在同一批录像上同时拿到盲法与知情两套评分"——这需要至少两位评分者、严格的信息隔离与额外的评分工作量。这个困难本身就是研究内容：课题问的正是"知不知道分组会让结果差多少"，所以双轨评分不是额外负担，而是产生主结论的那一步。

选择前提： 适合能严格执行信息隔离、能接受"主结论可能否定自己预期"的学生，且必须先落实实体实验室。不适合想快速拿到一个显著结果的学生——本课题的设计就是为了让显著性更难获得；也不适合无法长期维护活体培养的学生。

预算裁剪顺序： 主要成本是化学品与培养维护，总额不高。时间不足时的裁剪顺序为：先砍第 7 步（自动化指标交叉校验），再把浓度点从 4 个减到 3 个（不得少于 3 点 + 对照，否则 4PL 无法拟合），再把评分者从 3 位减到 2 位（盲法 + 知情各一位是最低配置，不可再减）。不可砍的是个体内重测——砍掉它 H2 就没了，而 H2 是本课题的兜底。

合规与表格： - 脊椎动物红线：本课题刻意全程使用无脊椎动物。 规则规定脊椎动物毒性研究全面禁止（明确点名含酒精、酸雨、农药、重金属），不得死亡、不得超过瞬时或轻微疼痛，体重下降上限 15%；斑马鱼受精后 7 天（7 dpf）起即算脊椎动物，头足类按脊椎动物对待。因此用鱼做同一实验直接违规，这是本条必须坚持无脊椎动物的唯一原因，不是偏好问题。无脊椎动物的毒性研究是规则允许的，这也是整个 ANIM 类目里学生能自己跑完实验的少数路径之一。 - 实验后处置必须在研究计划中写死： 暴露过的个体一律不得放归自然水体（规则明确禁止向环境引入非本地物种、病原体与有毒化学品），须灭活后按固废处理；含草甘膦废液按危险废物处置。 - 不触发 PHBA。 无微生物培养、无 rDNA、无组织、无血液。家中禁止培养任何潜在危险生物制剂（规则点名连 BSL-1 与 C. elegans 都不行）——本课题不培养微生物，但化学暴露实验本身也不应在家中进行，须有实体实验室与受训的 Direct Supervisor / Qualified Scientist。因此不需要扣除 PHBA 的 2–6 周 SRC 事前审批，本课题的时间瓶颈在培养稳定性与实验室准入，不在生物审批。 - 抗生素耐药性研究基本封死、朊病毒样蛋白全面禁止（Aβ、tau、α-syn、TDP-43、Huntingtin 及编码这些蛋白的质粒）——本课题均不涉及。 - 化学品分级须自查（2027 新增条款）： 若草甘膦制剂或其助剂在 SDS 上被标为致癌、致畸或生殖系统损害，则必须在 RRI 或限制进入的通风橱内操作，不得在普通教室完成。 这一条必须在选定具体产品后逐条核对，不得凭"农药很常见"就略过。 - 须填表格： Form 1、Form 1A（含研究计划，须含危险化学品的风险评估过程、监督安排与具体处置方法，并须查阅 SDS）、Form 1B、Form 2A（2027 新增，所有项目必填）、Form 3（危险化学品/装置，本课题必填且是重点）、Abstract（实验后）。若在大学实验室进行，追加 Form 2C（原 RRI 表，须在展台竖立展示）与 Form 2B（Qualified Scientist，注意其新增的"支持时长"提问）。 - 展台： 禁活体、液体（含水）、土壤、玻璃、化学品——水蚤、暴露液、培养缸一律不得上台。展台靠 4PL 剂量-反应曲线、盲法/知情效应量对照图、ICC 与所需样本量曲线、轨迹热图与实验照片撑起。 - AI 政策： 不得用生成式 AI 撰写研究计划、摘要、展板或生成引文；追踪与统计脚本若由 AI 生成，须显式引用并保留提示词日志。

评分： O=6, W=8, F=7, S=6, Fit=9 → base=70.0，h=9 → [61, 79]，置信度：中

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